一、實驗目的

1．了解一級菌種培養基配制的原則；

2．掌握一級菌種培養基配制的工藝流程；

3．學會一級菌種培養基配制的具體方法步驟；

4．學會棉塞的制作方法和手提式高壓蒸汽鍋的使用方法。

二、實驗設備、工具和材料

手提式高壓鍋、1000～1500W電爐、感量1／10g的粗天平、1000mL量杯、玻璃漏斗、漏斗架各一個，8～10cm長乳膠管一根，止流夾一個，20mm×200mm試管150支左右，鐵絲筒兩個，小刀和剪子一把，普通棉花250g，牛皮紙、馬鈴薯、瓊脂和葡萄糖或蔗糖適量。

三、實驗步驟

(1)取適量馬鈴薯，削去皮，挖去芽眼。稱取200g，切成薄片或小塊，用清水淘洗之后，放入鍋內，加水1200mL，用文火煮沸20～30min，用四層紗布過濾，取濾液1000mL，如不足加水補足1000mL。

(2)稱取瓊脂20g，洗凈剪碎，加入馬鈴薯煮出液中，用文火加熱，邊煮邊攪拌，直至全部瓊脂融化，再用四層紗布過濾，并用熱水補足1000mL，加入預先溶解的葡萄糖水，攪拌之后煮2min后停火。

(3)分裝試管。根據要求，用1%鹽酸或1%氫氧化鈉溶液調整酸堿度后，將培養基趁熱分裝在試管中。

先在玻璃漏斗嘴上套一段長8～10cm的乳膠管，卡上止流夾，將培養基倒入漏斗中（其余培養基要置電爐上保溫）。左手握住3～5支試管，讓乳膠管伸入試管中部，右手拇指和食指按下止流夾，逐一注入培養基，裝入量以試管長度的1/5～1／4為宜。分裝時不要讓培養基沾在試管口上，若已沾上，要用干凈紗布擦干凈。

(4)塞棉塞。培養基分裝試管后，要塞上棉塞。

制作棉塞的方法很多，這里介紹一種常用的方法。取適量棉片，在桌上鋪成長12～15cm，寬12cm左右的薄棉墊，先將棉墊下部1／3向上折疊，再將上部1／3向下折疊，然后將長棉墊逆時針方向轉90°，讓光滑的一邊向左用右手持棉墊并用拇指按住，左手拇指和食指向外旋卷，并將參差不齊的棉纖維纏住呈一圓柱形。用右手按順時針方向將棉塞塞進管口內，塞入部分為棉塞長度的2/3。

(5)捆扎試管。塞好棉塞之后，應將試管捆成束，并用牛皮紙將棉塞部分包扎好，裝進高壓鍋內滅菌。

(6)滅菌。用手提式高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。其步驟如下。

①加水。先向鍋內加水，略超過支架。

②裝鍋。將包扎好的試管直立放在內筒中，不要裝得過緊、過滿。

③關嚴鍋蓋。先將軟管對好內筒插孔，蓋嚴鍋蓋，對角旋緊旋鈕。

④加熱。插上電爐插頭或推上電閘加熱。

⑤排放冷空氣。開始加熱時將放氣閥打開，待看到有大量蒸汽排出后關上放氣閥。

⑥升壓保壓。排放冷空氣之后，繼續加熱，當壓力表指針達到0.11MPa時，開始計時，維持30min。

⑦降壓排氣。維持30min之后，拔下電源插頭或拉開電閘，使其自然冷卻，或從電爐上把鍋提下來，待壓力表指針降到零時，打開放氣閥，排放蒸汽。

⑧出鍋。排完氣后，松開旋鈕，將鍋蓋揭開一小縫，待培養基溫度降至60℃左右時，取出試管。

⑨擺斜面。試管從鍋內取出后，要將試管一支一支地散放在桌面上的小木條上，使之冷卻成斜面。斜面長度為試管長度的2/3。

(7)空白實驗。將滅菌后的斜面試管，各組隨機抽取幾支，放在28～32℃溫箱中空白培養48～72h，如無任何雜菌生長，說明滅菌*，才可使用。